Nel campo della biofermentazione, i serbatoi di fermentazione in vetro sono da sempre l'attrezzatura preferita dal personale addetto all'ottimizzazione dei processi, soprattutto in laboratorio e nelle fasi su piccola scala. I serbatoi di fermentazione in vetro sono trasparenti e intuitivi, facili da pulire e relativamente economici, pur soddisfacendo le esigenze di coltura della maggior parte dei microrganismi. I serbatoi di fermentazione in vetro da 5 litri sono particolarmente diffusi.
I. Materiale del serbatoio
La scelta di un serbatoio di fermentazione in vetro adatto inizia con la valutazione del materiale. Il vetro borosilicato ad alto contenuto di boro è attualmente riconosciuto come la scelta migliore perché combina stabilità chimica, proprietà termiche e trasparenza fisica. Il processo di fermentazione è essenzialmente l'attività metabolica dei microrganismi in un ambiente artificiale. Il brodo di fermentazione ha una composizione complessa, che include sali inorganici, sistemi tampone, acidi organici, enzimi e metaboliti secreti dai microrganismi. Il vetro borosilicato ad alto tenore di carbonio, grazie all'introduzione di una grande quantità di triossido di boro durante il processo di produzione, forma una struttura reticolare silicio-ossigeno altamente stabile, che gli conferisce un'elevatissima resistenza all'acqua, agli acidi, alle basi e a diversi solventi organici. Questo serbatoio inerte non rilascia elementi aggiuntivi nel brodo di fermentazione né ne assorbe i componenti attivi, garantendo così l'autenticità dei dati e la costanza del lotto.
Per quanto riguarda le proprietà termiche, il vetro borosilicato ad alto tenore di carbonio risolve il problema di affidabilità più critico per i materiali in vetro. I serbatoi di fermentazione sono quasi sempre sottoposti a sterilizzazione ad alta temperatura e devono sopportare ciclicamente temperature ambiente, di sterilizzazione e di coltivazione. Queste drastiche variazioni di temperatura impongono al materiale una resistenza agli shock termici estremamente elevata. Il vetro borosilicato ad alto tenore di carbonio ha un coefficiente di dilatazione termica pari a circa un terzo di quello del vetro comune, il che gli consente di resistere a variazioni di temperatura istantanee di centinaia di gradi Celsius senza subire danni.
Dal punto di vista dell'osservazione del processo, la trasparenza del vetro borosilicato ad alto contenuto di boro gli conferisce un valore unico che nessun metallo può sostituire. Gli operatori devono monitorare costantemente le variazioni delle condizioni del serbatoio e il vetro borosilicato ad alto contenuto di boro non solo ha un'elevata trasmissione della luce, ma non ingiallisce facilmente con l'uso prolungato, mantenendo un campo visivo sempre ottimale. Attraverso le pareti del serbatoio, i tecnici possono valutare direttamente se l'agitazione è uniforme, se lo strato di schiuma è troppo alto, se i microrganismi si aggregano o aderiscono e persino percepire lo stato metabolico attraverso i cambiamenti di colore. Queste informazioni visive intuitive sono spesso più dirette dei dati dei sensori.
II. Volume
Il volume nominale di un fermentatore in vetro da 5 litri si riferisce al volume totale del serbatoio di 5 litri, ma il riempimento effettivo del liquido è generalmente controllato intorno al 70%, che corrisponde a circa 3,5 litri di terreno di coltura. Se viene riempito eccessivamente, la schiuma tende a fuoriuscire durante l'agitazione, ostruendo il filtro di scarico e causando persino contaminazione; se viene riempito troppo poco, ciò incide negativamente sulla redditività. Il rapporto diametro-altezza viene spesso trascurato; Il design più diffuso è una forma slanciata con un rapporto di circa 1:2,2–1:2,5. Questo rapporto può prolungare il tempo di permanenza delle bolle d'aria nel liquido, migliorare il coefficiente di trasferimento dell'ossigeno (valore kLa) ed è particolarmente adatto per colture ad alta densità di microrganismi aerobici come E. coli, lieviti o Bacillus subtilis. Se l'esperimento è sensibile alle forze di taglio (come nel caso di alcuni funghi o cellule animali), è possibile scegliere un rapporto leggermente più corto e più largo, ma in generale, 1:2,5 è la scelta più equilibrata.
III. Metodi di sterilizzazione
Il metodo di sterilizzazione è un fattore cruciale nella scelta dei fermentatori in vetro da laboratorio. La sterilizzazione esterna è attualmente la scelta più comune per i fermentatori in vetro da 5 litri nei laboratori. La procedura prevede innanzitutto la rimozione del coperchio superiore in acciaio inox del reattore, il versamento del terreno di coltura precedentemente preparato, la chiusura del coperchio superiore e infine il posizionamento dell'intero fermentatore (compresi il corpo del serbatoio, gli elettrodi, le bottiglie di alimentazione, i tubi e gli altri accessori) in un'autoclave per la sterilizzazione. I vantaggi sono una struttura del reattore semplice e un basso costo di produzione (dal 30% al 100% più economico rispetto alla sterilizzazione in situ); è adatta alla maggior parte degli scenari didattici, di screening dei ceppi e di ricerca di routine. Lo svantaggio è che richiede smontaggio, rimontaggio e manipolazione prima e dopo ogni esperimento, il che richiede tempo. Sebbene la sterilizzazione fuori sede sia leggermente più complessa, offre un elevato rapporto costo-efficacia; purché l'autoclave possa ospitare il serbatoio da 5 litri e i relativi accessori, la sterilizzazione fuori sede è la soluzione ottimale.
La sterilizzazione in situ prevede l'introduzione diretta di vapore ad alta temperatura nel fermentatore e nella camicia dopo l'installazione, tramite le tubazioni del vapore, le valvole e il sistema di controllo integrati nell'apparecchiatura. Ciò elimina la necessità di smontaggio ed è particolarmente adatta per processi che richiedono frequenti cambi di lotto o quelli che necessitano di un'estrema sterilità per la validazione su scala industriale. Per i fermentatori in vetro, il rapido riscaldamento/raffreddamento e le fluttuazioni di pressione durante la sterilizzazione in situ generano un notevole stress termico, che può facilmente portare al cedimento della guarnizione dell'interfaccia o al danneggiamento degli elettrodi. L'attrezzatura richiede inoltre generatori di vapore aggiuntivi, valvole automatiche, sensori di pressione e una struttura in vetro rinforzato, aumentando significativamente i costi. Anche le riparazioni in caso di problemi risultano più complesse. Pertanto, la sterilizzazione in situ è relativamente rara nei serbatoi in vetro e si trova principalmente nei serbatoi in acciaio inossidabile.
IV. Sistema di agitazione
Il sistema di agitazione determina l'uniformità della miscelazione, il trasferimento di ossigeno e il controllo della forza di taglio, ed è il "cuore" del fermentatore. Per i reattori in vetro da 5 litri utilizzati per la fermentazione microbica, si utilizza in genere un servomotore CC da 100-300 W o un motore CA a frequenza variabile per l'agitazione. Questi motori sono piccoli, silenziosi, non richiedono manutenzione e offrono una regolazione continua e precisa della velocità. Supportano inoltre il controllo PID digitale, facilitando il collegamento con il controllore di fermentazione per regolare l'ossigeno disciolto e la forza di taglio. I normali motori asincroni dovrebbero essere evitati a causa della loro scarsa precisione nella regolazione della velocità, che non soddisfa i requisiti di stabilità e ripetibilità della velocità richiesti dalla fermentazione.
Le tenute meccaniche sono un metodo di tenuta dinamica comune nei sistemi di agitazione dei fermentatori in vetro, utilizzati principalmente nei sistemi di agitazione meccanica con ingresso dall'alto. Le tenute meccaniche si dividono in tenute meccaniche a singola superficie di tenuta e tenute meccaniche a doppia superficie di tenuta. Le prime sono costituite da un solo anello rotante (che ruota con l'albero) e un anello fisso (fissato al coperchio del serbatoio), e si basano sull'autolubrificazione del terreno di coltura all'interno del serbatoio. Hanno una struttura semplice, un costo contenuto e un'efficiente trasmissione della coppia, il che le rende adatte ai reattori in vetro da laboratorio. Le seconde si basano su due serie di tenute a superficie di tenuta collegate in serie, che formano una camera di lavaggio centrale, attraverso la quale viene introdotto uno speciale fluido di tenuta, creando una doppia barriera. Anche in caso di piccole perdite interne, i contaminanti esterni non possono entrare, garantendo una maggiore igiene.
L'agitazione con accoppiamento magnetico dal basso è una soluzione di agitazione asettica comune nei reattori in vetro da 5 litri per la fermentazione microbica. La differenza visiva più significativa è l'assenza di un motore sul coperchio superiore, mentre il reattore presenta una base aggiuntiva. Il motore è installato nella parte inferiore e l'anello magnetico esterno ruota con il motore, azionando l'anello magnetico interno (integrato con l'albero di agitazione e la girante) tramite un forte accoppiamento del campo magnetico. Ciò evita che l'albero dell'agitatore penetri le pareti o il coperchio del serbatoio, eliminando la necessità di tenute meccaniche o guarnizioni e garantendo un'agitazione completamente senza contatto. I vantaggi dell'agitazione ad accoppiamento magnetico includono un'estrema sterilità, l'eliminazione completa delle zone morte e dei rischi di perdite associati alla penetrazione dell'albero, l'assenza di usura delle guarnizioni, la non necessità di sostituzione o lubrificazione periodica degli O-ring e una lunga durata. Inoltre, genera una miscelazione assiale e radiale dal basso verso l'alto, con conseguente distribuzione più uniforme del gas (se utilizzato con un getto anulare) e spesso un trasferimento di ossigeno disciolto (kLa) più elevato, soprattutto in fluidi a basso volume o ad alta viscosità. La forza di taglio è relativamente delicata, il che la rende più adatta a ceppi sensibili (come alcuni funghi filamentosi). Lo svantaggio è che l'accoppiamento magnetico comporta il rischio di disaccoppiamento. Se la viscosità del terreno di coltura diventa troppo elevata, la velocità di rotazione è troppo alta o il carico è troppo pesante, gli anelli magnetici interno ed esterno possono staccarsi momentaneamente, causando l'arresto dell'agitazione. Per le fermentazioni ad alta densità o con elevata viscosità (ad esempio, in presenza di particelle solide) è necessaria un'attenta selezione di un sistema di azionamento magnetico ad alta coppia.
Per la maggior parte dei reattori in vetro da 5 litri utilizzati in laboratorio per la fermentazione microbica, l'agitazione meccanica combinata con una tenuta meccanica a un'estremità è la scelta più economica e pratica. È semplice, affidabile e di facile manutenzione, ed è stata validata da numerosi marchi. Viene utilizzata solo quando sono richiesti elevati requisiti di sterilità, con ceppi ad alto rischio o per processi speciali. Per una maggiore sicurezza, si consiglia di valutare l'aggiornamento a una tenuta meccanica a doppia estremità o a un agitatore con accoppiamento magnetico inferiore.
V. Giranti
La girante è un componente chiave che influenza l'uniformità della miscelazione, il coefficiente di scambio termico con l'ossigeno (kLa), la forza di taglio e il consumo energetico. Il materiale della girante è acciaio inossidabile 316L con superficie elettrolucidata. Il principio fondamentale nella scelta di un agitatore è quello di bilanciare un elevato trasferimento di ossigeno (necessario per i microrganismi aerobici) con una bassa forza di taglio (per proteggere le cellule).
Gli agitatori a turbina sono la scelta più comune per la fermentazione microbica, in quanto generano principalmente un flusso radiale, disgregano le bolle e aumentano significativamente il valore di kLa. Sono adatti per fermentazioni ad alta densità con elevate esigenze di ossigeno (come quelle di E. coli e lieviti). La forte dispersione del gas e l'elevata efficienza di trasferimento dell'ossigeno dell'elica a pale oblique sono state verificate da numerosi studi e marchi. Uno svantaggio è che le alte velocità possono danneggiare funghi filamentosi o microrganismi sensibili.
L'elica a pale oblique, con pale installate a circa 45°, genera sia un flusso radiale che assiale, con conseguente miscelazione più uniforme, minore forza di taglio rispetto alle eliche a turbina e un migliore trasferimento di ossigeno. È adatta per terreni di coltura a media viscosità o per microrganismi che sono in qualche modo sensibili alla forza di taglio. In combinazione con un'elica a turbina di dimensioni inferiori, può migliorare la circolazione generale e ridurre le zone morte. Uno svantaggio è che la sua dispersione del gas è leggermente inferiore rispetto a quella di un'elica a turbina pura.
L'elica a flusso assiale genera principalmente un flusso assiale, ha la forza di taglio più bassa ed è adatta a substrati a bassa viscosità. Per le coltivazioni con basse esigenze di taglio, le giranti a flusso assiale offrono un minore consumo energetico e una maggiore efficienza, rendendole adatte a funghi filamentosi o ceppi altamente sensibili al taglio. Il processo di agitazione è relativamente delicato, con minore formazione di schiuma e minore consumo energetico. Gli svantaggi sono la dispersione del gas e i valori di kLa relativamente bassi, che le rendono inadatte per fermentazioni a crescita rapida con esigenze di ossigeno estremamente elevate.
La configurazione più comune e consigliata per un fermentatore in vetro da 5 litri è una girante combinata a 2-3 strati: la girante a turbina inferiore è responsabile della dispersione del gas, scomponendo il gas in ingresso in microbolle; la girante a pale inclinate superiore è responsabile della circolazione assiale, prevenendo la sedimentazione cellulare e distribuendo uniformemente le bolle disperse dallo strato inferiore in tutto il serbatoio; è possibile aggiungere una girante antischiuma meccanica supplementare.